ხამანწკის სოკოს ლაკაზას NRC 620 წარმოება და ბიოქიმიური დახასიათება და მისი ეფექტურობის შეფასება ვაშლის წვენის გასუფთავებაში.

28°C ტემპერატურაზე 25-დღიანი სტატიკური ინკუბაციის შემდეგ, *Pleurotus ostreatus* NRC620-დან ლაკაზამ სოკოვანი კულტურის გარემოში ყველაზე მაღალი აქტივობა აჩვენა. ამ ფერმენტისთვის ოპტიმალური pH და ტემპერატურის მნიშვნელობები შესაბამისად 3.0 და 70°C იყო. 40°C და 50°C ტემპერატურაზე 2-საათიანი ინკუბაციის შემდეგ, ფერმენტის აქტივობა შესაბამისად 68.33% და 59.61% შეინარჩუნა. ციტრატ-ფოსფატურ ბუფერში (pH 7.0) 2-საათიანი ინკუბაციის შემდეგ, ფერმენტის აქტივობა 100%-ზე დარჩა. 10 mM MgSO₄-ის და CuSO₄-ის დამატებამ ფერმენტის აქტივობა დაახლოებით 21%-ით და 35%-ით გაზარდა, შესაბამისად, ხოლო NaCl-მა, MnCl₂-მა, KCl-მა და CaCl₂-მა ფერმენტის აქტივობა დათრგუნა. ABTS-ის სუბსტრატად გამოყენებით, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 ლაკაზას კინეტიკური პარამეტრები (Km და Vmax) შესაბამისად 1.99 mM და 16,217 μmol min−1 L−1 იყო. ვაშლის წვენის ნიმუშების ფერმენტულმა დამუშავებამ მნიშვნელოვნად შეამცირა როგორც pH, ასევე სიბლანტე და ეს შემცირება კორელაციაში იყო შენახვის დროის ზრდასთან. ლაკაზას დამუშავებამ გამოიწვია ვაშლის წვენის ფენოლური შემცველობის უმნიშვნელო შემცირება, მაგრამ ანტიოქსიდანტური აქტივობის შემცირება არ დაფიქსირებულა.
ბოლო წლებში მკვლევარები ყურადღებას ამახვილებენ მწვანე ბიოტექნოლოგიის გამოყენებაზე კვების მრეწველობაში. ლაკაზა კვების მრეწველობაში ერთ-ერთი ყველაზე სასარგებლო ფერმენტია, რომელიც გამოიყენება ისეთ სფეროებში, როგორიცაა წვენის გადამუშავება, ცხობა, ღვინის სტაბილიზაცია და საკვები პროდუქტების ორგანოლეპტიკური თვისებების გაუმჯობესება.¹ლაკაზას გამოყოფენ მრავალი უმაღლესი მცენარე და მიკროორგანიზმი,²და სოკოებს, როგორიცაა დეიტერომიცეტები, ასკომიცეტები და ბაზიდიომიცეტები, ასევე შეუძლიათ ლაკაზას წარმოქმნა.³ლაკაზა (EC 1.10.3.2) არის ლურჯი ოქსიდაზა, რომელიც აღადგენს მოლეკულურ ჟანგბადს წყლად, სამი განსხვავებული სპილენძის ატომისგან შემდგარი სისტემის გამოყენებით, რითაც ჟანგავს სხვადასხვა ფენოლის ნაერთებს და არომატულ ამინებს. ხილისა და ბოსტნეულის წვენების წარმოების დროს ფერმენტული და არაფერმენტული შეყავისფრება კრიტიკულ საკითხებს წარმოადგენს.⁴რადგან ეს ნივთიერებები უარყოფითად მოქმედებს წვენის ფერზე, გემოსა და არომატზე, ისინი უნდა მოიხსნას.⁵
ყველა ხილიდან, ვაშლი მსოფლიოში და ევროკავშირში ყველაზე მეტად მოიხმარება. 2019 წელს ვაშლის წარმოებამ გლობალურად მესამე ადგილი დაიკავა, 87 მილიონ ტონას გადააჭარბა.⁶ვაშლი შეიცავს მრავალ ფენოლურ ნაერთს, მათ შორის ფლავონოიდებს და ფენოლის მჟავებს, როგორიცაა კოფეინის მჟავა და ქლოროგენის მჟავა.⁷რადგან ვაშლის წვენი, როგორც წესი, გამჭვირვალე სახით მოიხმარება, ფილტრაციის პროცესში ფენოლური კომპონენტების დაახლოებით 50%-დან 90%-მდე იკარგება.⁸დღესდღეობით, მომხმარებლები, როგორც წესი, მინიმალურად დამუშავებულ პროდუქტებს ირჩევენ, როგორიცაა მღვრიე ვაშლის წვენი პოლიფენოლების მაღალი შემცველობით. თუმცა, ფენოლების მაღალი შემცველობის გამო, ვაშლის წვენის ეს სახეობა განსაკუთრებით მგრძნობიარეა ფერის შეცვლისა და გამუქების მიმართ.⁹ვაშლის წვენის გამუქების შესამცირებლად ან თავიდან ასაცილებლად გამოიყენება სხვადასხვა ტექნოლოგია, მათ შორის თერმული დამუშავების მეთოდები, როგორიცაა პასტერიზაცია 60–90°C ტემპერატურაზე.¹⁰თუმცა Sauceda-Gálvez-ის კვლევის მიხედვით¹¹თერმულ დამუშავებას შეუძლია აქროლადი ქიმიკატების განადგურება და ვაშლის წვენის ორგანოლეპტიკურ თვისებებზე გავლენის მოხდენა. თერმული დამუშავების მეთოდების ალტერნატივებია ზეკრიტიკული ნახშირორჟანგი, ულტრაიისფერი გამოსხივება, ულტრაბგერითი გამოსხივება, მაღალი ჰიდროსტატიკური წნევა ან მაღალი წნევის ჰომოგენიზაცია.¹²ამ ტექნოლოგიების ეფექტურობა და შესაფერისი ხილის წვენების მოსავლიანობა დამოკიდებულია გამოყენებულ პარამეტრებსა და პროდუქტის მახასიათებლებზე. მათი ფართო გამოყენება შეზღუდულია მაღალი ფასებით, ზოგიერთი საკვები პროდუქტის ხარისხზე უარყოფითი ზემოქმედებით ან ფერმენტების არასაკმარისი ინაქტივაციით.^13,14
ლაკაზას გამოყენება შესაძლებელია ხილის წვენის სტაბილიზაციისა და გასუფთავებისთვის.¹⁵გოკმენი და სხვ.¹⁶ხილის წვენის გასასუფთავებლად ლაკაზას გამოყენებას გირჩევთ, რადგან ის ეფექტურად აშორებს ფენოლის ნაერთებს პოლიმერებად ან ოლიგომერებად გარდაქმნით, რომლებიც ადვილად აშორებენ ნებისმიერი ულტრაფილტრაციული მემბრანით, რაც ვაშლის წვენს საშუალებას აძლევს, 50°C ტემპერატურაზე ექვს კვირამდე შეინარჩუნოს სტაბილური ფერი და გამჭვირვალობა. გაწმენდილი *Trichoderma* ლაკაზა იმობილიზებული იყო ალუმინის მძივებზე და გამოყენებული იყო ვაშლის წვენის მიკრობული დაბინძურებით გამოწვეული უსიამოვნო არომატის ნაერთების შერჩევით მოსაშორებლად.¹⁷
ვაშლის წვენის აქროლადი კომპონენტების დაახლოებით 80-90% ეთერები და ალდეჰიდებია, რომლებიც წვენს უნიკალურ არომატს ანიჭებენ.¹⁸ვაშლის წვენის გასასუფთავებლად *Trametes versicolor*-ის ლაკაზა იმობილიზებული იყო ახალგაზრდა ქოქოსის ნაჭუჭების ნატურალური ბოჭკოებისგან დამზადებულ იაფ საყრდენზე.¹⁹წინა კვლევებში შესწავლილი იყო ვაშლის წვენის სტაბილიზაცია (ფერი და სიმღვრივე) ფერმენტებისგან თავისუფალი ან იმობილიზაციის მეთოდების გამოყენებით, ან ულტრაფილტრაციასთან კომბინაციაში.^5,19თუმცა, სოკოვანი ლაკაზების გავლენა ვაშლის წვენის ფიზიკურ-ქიმიურ თვისებებზე შენახვის დროს გაურკვეველი რჩება. ამიტომ, ამ კვლევის მიზანი იყო ექსპერიმენტულად გამოკვლეულიყო ვაშლის წვენის ფიზიკურ-ქიმიური თვისებების, ფენოლური ნაერთების შემცველობისა და ანტიოქსიდანტური აქტივობის ცვლილებები სოკოვანი ლაკაზებით დამუშავებისა და ორკვირიანი მაცივარში შენახვის შემდეგ. ლაკაზებს აქვთ ფენოლური ნაერთების დაჟანგვის უნარი, რაც მათ პერსპექტიულს ხდის სხვადასხვა სამრეწველო პროცესებში გამოსაყენებლად, მათ შორის წვენის გასუფთავებისთვის. ამ კვლევაში შესწავლილი იყო *Pleurotus ostreatus* NRC 620-ის ლაკაზები, ფოკუსირებული იყო მათი აქტივობისა და წვენის გასუფთავების ეფექტურობის იდეალურ პირობებზე. მიუხედავად იმისა, რომ ხამანწკის სოკოების (P. ostreatus NRC 620) კვლევა ჯერ კიდევ შეზღუდულია, წინა კვლევებში შესწავლილი იყო სხვადასხვა სოკოვანი წყაროდან მიღებული ფერმენტები, როგორიცაა Trametes versicolor და Ganoderma lucidum. ამ კვლევის მიზანი იყო ამ ფერმენტის კვების მრეწველობაში პოტენციური გამოყენების შეფასება და მისი უნიკალური თვისებების, განსაკუთრებით კი იდეალური pH-ისა და ტემპერატურის ხაზგასმა.
2,2′-აზოოქსიბის(3-ეთილბენზოთიაზოლინ-6-სულფონის მჟავა) (ABTS) შეძენილი იქნა Sigma-Aldrich-ისგან (კანადა). ყველა სხვა რეაგენტი იყო ანალიტიკური კლასის.
ეროვნული კვლევითი ცენტრის მიკრობული კულტურის შეგროვების ცენტრმა მოიპოვა ხამანწკის ცნობილი შტამი NRC620. სუბკულტივაციის შემდეგ, ეს შტამი შეინახეს კარტოფილის დექსტროზას აგარის დახრილ ჭურჭელზე 4°C ტემპერატურაზე. ინოკულუმის მომზადების მეთოდი შემდეგი იყო: 10 დღის, სრულად განვითარებული მიცელიუმი დაითესა კარტოფილის დექსტროზას აგარის ფირფიტებზე და ინკუბირებული იქნა 28°C ტემპერატურაზე. 10 დღის შემდეგ, 12 მმ დიამეტრის სამი მიცელიუმის ბლოკი ამოიღეს აგარის მედიიდან სტერილური ლითონის სახვრეტის გამოყენებით და მოათავსეს 250 მლ ერლენმაიერის კოლბებში ბამბის საცობებით, რომლებიც შეიცავდა 50 მლ სტერილურ კულტურულ გარემოს (pH 5.0, როგორც ადრე იყო აღწერილი ოთმანის და სხვების მიერ).²⁰). კულტურები ინკუბირებული იყო 28°C ტემპერატურაზე 18 დღის განმავლობაში. შემდეგ კულტურები გაფილტრული იქნა Whatman No. 1 ფილტრის ქაღალდით და შედეგად მიღებული ზედა ფენა ფერმენტის წყაროდ გამოიყენებოდა.
ლაკაზას აქტივობა განისაზღვრა ABTS-ის გამოყენებით, როგორც სუბსტრატი. რეაქციის ნარევი (2 მლ) შეიცავდა 500 μL 0.3 mM ABTS-ს (გახსნილი 0.1 M ნატრიუმის ციტრატის ბუფერში, pH 4.5) და ფერმენტის ნიმუშის საჭირო რაოდენობას, რომელიც განზავებული იყო გამოხდილი წყლით.^21,22იმის გათვალისწინებით, რომ ლაკაზას შეუძლია ABTS-ის დაჟანგვა ოთახის ტემპერატურაზე (28 °C ± 2), ABTS-ის დაჟანგვა განისაზღვრა 420 ნმ-ზე შთანთქმის ზრდის გაზომვით (ε₄₂₀= 36,000 სმ^-1 M ^-1) Agilent Carry-100 ულტრაიისფერი სპექტროფოტომეტრის გამოყენებით. წუთში 1 μmol ABTS-ის დაჟანგვისთვის საჭირო იყო ლაკაზას აქტივობის ერთი ერთეული. ცილის კონცენტრაცია განისაზღვრა ბრედფორდის მეთოდით, შიდა კონტროლის სახით მსხვილფეხა რქოსანი პირუტყვის შრატის ალბუმინის გამოყენებით.^23,24
ხამანწკის სოკოს NRC 620 შტამიდან ფერმენტის მიღების შემდეგ, მისი აქტივობა იზომებოდა სხვადასხვა კულტივირების ინტერვალებით 25 დღის განმავლობაში, სტატიკურ პირობებში 28°C ტემპერატურაზე.
ლაკაზას აქტივობაზე ტემპერატურის გავლენის შესასწავლად, ექსპერიმენტები ჩატარდა 20-დან 90°C-მდე ტემპერატურის დიაპაზონში. ფერმენტის დამატებამდე და რეაქციის დაწყებამდე, ბუფერი (0.1 M ნატრიუმის ციტრატი, pH 4.5) და სუბსტრატი (ABTS) შერეული იყო და ინკუბირებული იყო 5 წუთის განმავლობაში სხვადასხვა ტემპერატურაზე. ფერმენტის თერმული სტაბილურობა შეფასდა 0.05 M ნატრიუმის ფოსფატის ბუფერში (pH 7.0) ინკუბაციით, შესაბამისად, 40, 50, 60 და 70°C ტემპერატურაზე 2 საათის განმავლობაში. ნარჩენი აქტივობა შემდეგ შეფასდა ABTS სუბსტრატის გამოყენებით.
ლაკაზას აქტივობაზე pH-ის გავლენა შეფასდა ABTS-ის გამოყენებით, როგორც სუბსტრატისა, 0.1 M ციტრატ-ფოსფატურ ბუფერებში, pH დიაპაზონით 2.5-დან 7.0-მდე. ფერმენტული ხსნარი ინკუბირებული იქნა 40°C ტემპერატურაზე ორი საათის განმავლობაში 0.1 M ციტრატისა და Tris ბუფერებში (pH 3, 4, 6 და 7) pH სტაბილურობის შესაფასებლად. ABTS-ის, როგორც სუბსტრატის, გამოყენებისას ნარჩენი აქტივობა გამოითვალა ინკუბაციის შემდეგ.
ლაკაზა 10 წუთის განმავლობაში ინკუბირებული იყო ნატრიუმის ფოსფატის ბუფერში (0.05 M, pH 7.0), რომელიც შეიცავდა სხვადასხვა ლითონის იონებს (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ და Mn2+) შესაბამისად 2.5 mM და 10 mM კონცენტრაციებით. შემდეგ რეაქციის დასაწყებად დაემატა სუბსტრატი (ABTS) და შეფასდა მისი ფარდობითი აქტივობა.
ლაკაზათი ABTS-ის დაჟანგვა სხვადასხვა კონცენტრაციით (0.025–3 mM) გაიზომა pH 4.5-ზე კინეტიკური პარამეტრების (Vmax და Km) დასადგენად.^{მუდმივები}მიქაელის-მენტენის განტოლების მნიშვნელობები გამოითვალა Lineweaver-Burk დიაგრამის გამოყენებით, რომელიც ასახავს რეაქციის სიჩქარის შებრუნებულ მნიშვნელობას სუბსტრატის კონცენტრაციის ფუნქციის სახით. კინეტიკური მუდმივები გამოითვალა Lineweaver-Burk დიაგრამიდან GraphPad Prism ვერსია 6.01 პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით.
ვაშლები ონკანის წყლით კარგად გარეცხვის შემდეგ, ისინი შუაზე გაჭრეს და სრულად ავტომატური Braun MP80 ვაშლის წვენსაწურით (წარმოებულია გერმანიაში) გამოწურეს. წვენი გაფილტრეს მატყლის ოთხ ფენაში. საკონტროლო ჯგუფს ფერმენტები არ დაემატა, ხოლო ახლად მომზადებულ ვაშლის წვენს 2.0% ლაკაზა (ტესტირებული ყველაზე ეფექტური კონცენტრაცია) დაემატა, რომელიც შემდეგ ორი კვირის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე შეინახეს.
ტიტრაციული მჟავიანობა (TA) და pH განისაზღვრა ბოულტონის და სხვათა მეთოდის მიხედვით.^ალ.27თითოეული ნიმუშის pH გაიზომა ციფრული pH მრიცხველის (JENWAY 3510 pH მრიცხველი) გამოყენებით. ტიტრაციული მჟავიანობა (TA) გამოითვალა ვაშლის მჟავას საფუძველზე შემდეგი ფორმულის გამოყენებით.
სადაც V და C შესაბამისად ტიტრაციაში გამოყენებული ნატრიუმის ჰიდროქსიდის ხსნარის მოცულობა (მლ) და კონცენტრაციაა (0.1 მოლ/ლ). K არის ვაშლის მჟავას გარდაქმნის კოეფიციენტი, რომელიც უდრის 0.067-ს, ხოლო W არის ვაშლის წვენის მასა (გ).
ხსნადი მყარი ნივთიერებების საერთო რაოდენობა (^TDSყველა წვენის ნიმუშის ) შემცველობა განისაზღვრა PAL-1 ჯიბის რეფრაქტომეტრის გამოყენებით (ATAGO, ტოკიო, იაპონია). თითოეული გაზომვის შემდეგ, ოპტიკური ლინზა გამოირეცხა დეიონიზებული წყლით და ვაშლის წვენის თითოეული ნიმუში სამჯერ იქნა გამოკვლეული. თითოეული ნიმუშის მნიშვნელობა გამოითვალა სამი გაზომვის საშუალო მნიშვნელობის გამოთვლით. ვაშლის წვენის თითოეული ნიმუშის საშუალო ± სტანდარტული გადახრა ასევე გამოითვალა ამ შედეგების საშუალო მნიშვნელობის გამოთვლით.
ვაშლის წვენის ნიმუშების ვისკოელასტიურობა შეფასდა ბრუნვითი ვისკომეტრის (RV, Rheotest 2, გერმანია) გამოყენებით. ნიმუში მოთავსდა ვისკომეტრის „S2“ ცილინდრში. ხილული სიბლანტე წარმოდგენილი იყო ძვრის სტრესის მრუდის დახრილობით ძვრის სიჩქარის მიმართ, რომელიც გამოითვალა ძვრის სტრესიდან და შესაბამისი მრუდებიდან სხვადასხვა ძვრის სიჩქარის დროს (1.00-დან 437.4 წმ-მდე). ხილული სიბლანტის გამოთვლის ფორმულა შემდეგია:
სადაც η არის აშკარა სიბლანტე (cP), τ არის ძვრის ძაბვა (დინ/სმ²), γ არის ძვრის სიჩქარე (წმ⁻¹) და (τ) გამოითვლება ბრუნვის მომენტის (α) და ცილინდრის (Z) მნიშვნელობების გამოყენებით შემდეგი ფორმულის გამოყენებით: τ = Z . α.
ყავის ინდექსი განისაზღვრა მეიდავის და სხვა მეთოდების მიხედვით.^ალ.2910 მლ წვენის ნიმუში დაცენტრიფუგირებული იქნა 2750 xg სიმძლავრით 10 წუთის განმავლობაში. წვენის ზედაპირული ხსნარის 5 მლ შეერია 5 მლ 95%-იან ეთანოლს. ნარევის შთანთქმა გაიზომა 420 ნმ-ზე Shimadzu UV სპექტროფოტომეტრის (UV-1601 PC) გამოყენებით.
ფენოლის საერთო შემცველობა (TPC) განისაზღვრა კოლორიმეტრიულად ფოლინ-ჩიოკალტეუს რეაგენტის გამოყენებით, როგორც ეს აღწერილია ბოულტონის და სხვების მიერ.^[27]] გალის მჟავას სტანდარტული მრუდი აგებული იყო 0-დან 500 მგ/ლ-მდე კონცენტრაციებისთვის (^r²= 0.997). შედეგები გამოხატულია გალის მჟავას ეკვივალენტებში (მგ GAE/მლ).
25 მკლ ვაშლის წვენს დაუმატეთ 125 მკლ გამოხდილი წყალი და 2850 მკლ FRAP ხსნარი და ნარევი გააჩერეთ სიბნელეში.³⁰წთ. შემდეგ გაზომეთ აბსორბცია 593 ნმ-ზე Shimadzu UV სპექტროფოტომეტრის (UV-1601 PC) გამოყენებით. FRAP რეაგენტი მომზადდა 300 mM აცეტატის ბუფერის (pH 3.6), 20 mM რკინის (III) ქლორიდის და 10 mM 2,4,6-ტრის(2-პირიდილ)ტრიაზინის (TPTZ) (გახსნილი 40 mM HCl-ში) შერევით 10:1:1 თანაფარდობით. სტანდარტული მრუდი შეიქმნა Trolox-ის, როგორც სტანდარტის გამოყენებით (^R²= 0.999), და შედეგები გამოხატულია μM ტროლოქსი/მლ-ში.
დამუშავებული და დაუმუშავებელი წვენების ანტიოქსიდანტური აქტივობა განისაზღვრა DPPH მეთოდის გამოყენებით, რათა შეფასებულიყო მათი DPPH თავისუფალი რადიკალების შთანთქმის უნარი.³¹ათი მიკროლიტრი წვენი შეერია მეთანოლში 1 მლ DPPH ხსნარს (100 μM). 30 წუთის განმავლობაში სიბნელეში რეაქციის შემდეგ, ნარევის შთანთქმა გაიზომა 517 ნმ-ზე Shimadzu UV სპექტროფოტომეტრის (UV-1601 PC) გამოყენებით. შედეგები გამოისახა ტროლოქსის ეკვივალენტებად (μM ტროლოქსი/მლ) კალიბრაციის მრუდის მიხედვით (_^R2= 0.990).
მიღებულმა მონაცემებმა აჩვენა, რომ NRC 620 ხამანწკის სოკოებში ლაკაზას მაქსიმალური წარმოება დაფიქსირდა დუღილის მე-18 დღის ბოლოს, მიაღწია 1302 ერთ/ლ აქტივობას. ეს საფუძვლად დაედო ლაკაზას წარმოებისთვის ოპტიმალური კულტივირების დროის განსაზღვრას (სურათი 1). მიუხედავად იმისა, რომ ფერმენტების წარმოება იზრდებოდა კულტივირების დროის ზრდასთან ერთად, ზრდის ტემპი არ იყო კულტივირების დროის პირდაპირპროპორციული; 21 დღის შემდეგ, ფერმენტების აქტივობა გაიზარდა მხოლოდ 90 ერთ/ლ-ით (1390 ერთ/ლ-მდე). ამიტომ, საბოლოოდ, 18 დღე შეირჩა კულტივირების ოპტიმალურ დროდ, რათა დაბალანსებულიყო პროდუქტის მოსავლიანობა კულტივირების გაზრდილი დროის ეკონომიკურ სარგებელთან.
კულტივირების დროის გავლენა ლაკაზას მოსავლიანობაზე Pleurotus ostreatus NRC 620-ში. სამი (12 მმ) სოკოვანი მიცელიუმის ბლოკი ინოკულირებული იქნა 50 მლ სტერილურ გარემოში და შემდეგ კულტივირებული იქნა 28°C ტემპერატურაზე სხვადასხვა დროის განმავლობაში.
სხვა კვლევებთან შესაბამისობაში, ჩვენი შედეგები მიუთითებს, რომ სოკოების მიერ ლაკაზას პიკური სეკრეციის მისაღწევად იდეალური კულტივირების პერიოდი, სავარაუდოდ, 7-დან 36 დღემდეა.³²ეზიკეს და სხვების მიხედვით.³³, *Trametes polyzona* WRF03-მა დუღილის მეცხრე დღის ბოლოს ლაკაზას ყველაზე მაღალი რაოდენობა გამოიმუშავა, 1637 ერთ./მგ ცილის სპეციფიკური აქტივობით. გარდა ამისა, ოთმანი და სხვ.³⁴აღმოჩნდა, რომ *Trichoderma harzianum* S7113-მა კულტივირების მეხუთე დღეს დიდი რაოდენობით ლაკაზა გამოყო. ლაკაზას წარმოების სიჩქარემ პიკს მეთოთხმეტე დღეს მიაღწია და შემდეგ თანდათან შემცირდა.³⁴მიუხედავად იმისა, რომ ფერმენტების სეკრეცია შეიძლება ასევე მოხდეს ზრდის ძირითადი ფაზის დროს, ის, როგორც წესი, პიკს აღწევს შუალედურ ფაზაში და გამოწვეულია ნახშირბადის ან აზოტის წყაროს მოხმარებით.^34,35
მიუხედავად იმისა, რომ Pleurotus ostreatus NRC 620-ის ლაკაზამ მაღალი აქტივობა გამოავლინა ფართო ტემპერატურის დიაპაზონში 50°C-დან 80°C-მდე, პიკურ აქტივობასთან ახლოს (69–98%), მისი მაქსიმალური აქტივობა დაფიქსირდა 70°C-ზე (სურ. 2ა). ამ ტემპერატურის დიაპაზონის გარეთ, ფერმენტის აქტივობა შემცირდა დაახლოებით 70°C-ზე. ეს შედეგები მიუთითებს, რომ ფერმენტი აქტიურია მაღალ ტემპერატურაზე, სავარაუდოდ იმიტომ, რომ მაღალი ტემპერატურა ზრდის რეაქციის კინეტიკურ ენერგიას.
რეაქციის ტემპერატურის (ა) და pH-ის (ბ) გავლენა ლაკაზას აქტივობაზე *Pleurotus ostreatus* NRC 620-ში. 20-დან 90°C-მდე ტემპერატურა მიღწეული იქნა ნარევის წინასწარი ინკუბაციით სხვადასხვა ტემპერატურაზე 5 წუთის განმავლობაში, ფერმენტის დამატებამდე და რეაქციის დაწყებამდე. pH-ის გავლენა ლაკაზას აქტივობაზე შეფასდა ABTS-ის გამოყენებით, როგორც სუბსტრატის, ხსნარებში, რომლებიც შეიცავდა 0.1 M ციტრატ-ფოსფატურ ბუფერს 2.5-დან 7.0-მდე pH დიაპაზონში.
ეზიკეს და სხვათა მიხედვით^ალ.33*Trametes polyzona* WRF03 ლაკაზასთვის ოპტიმალური ტემპერატურაა 55°C, რაც იგივეა, რაც *Ganoderma lucidum*-ისთვის.^{ლაკასი36}და მსგავსია *Trametes polyzona* KU-RNW02737-ის ოპტიმალური ტემპერატურისა (50 °C).^{ლაკაზა} . ^{ბალდრიანი38}აღნიშნავს, რომ ლიგნინის დამშლელი სხვა ფერმენტული სისტემების მსგავსად, ლაკაზასთვის იდეალური ტემპერატურის დიაპაზონი 50-დან 70°C-მდეა.
შედეგებმა აჩვენა, რომ ფერმენტმა ყველაზე მაღალი აქტივობა pH 3.0-ზე აჩვენა და pH 3.5-ზე 94%-იან აქტივობას მიაღწია. თუმცა, ის აქტიური დარჩა pH-ის ფართო დიაპაზონში 2.5-დან 7.0-მდე (სურათი 2ბ). გარდა ამისა, მან უფრო მაღალი აქტივობა გამოავლინა მჟავე პირობებში, ნეიტრალურ ან ტუტე პირობებთან შედარებით. მისი აქტივობა მინიმუმ 77%-ით შეინარჩუნა pH-ის 2.5-დან 4.5-მდე დიაპაზონში, მაგრამ pH 7.0-ზე მხოლოდ დაახლოებით 38%-ს მიაღწია. *Trametes polyzona* WRF03-დან მიღებული ლაკაზას ოპტიმალური pH იყო 4.533, რაც იგივეა, რაც *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 და *Trametes hirsuta* 41-დან მიღებული ლაკაზების pH. თუმცა, Chairin-ის და სხვების კვლევის თანახმად.⁴²*Polymorpha f. sp.* WR710-1-დან მიღებული ლაკაზას ოპტიმალური pH არის 2.2, ხოლო *Polymorpha f. sp.* IBL-04-დან მიღებული ლაკაზას ოპტიმალური pH არის 5.043. ჰიდროქსიდის ანიონების (ლაკაზას ინჰიბიტორი) შეკავშირება T2/T3 ლაკაზას სპილენძის ატომებთან შეიძლება იყოს ლაკაზას აქტივობის შემცირების მიზეზი ნეიტრალური ან ტუტე pH პირობებში. ამან შეიძლება დაარღვიოს შიდა ელექტრონების გადაცემა T1 ცენტრიდან T2/T3 ცენტრში, რითაც^{შემზღუდველი}ფერმენტული აქტივობა23,44
ფერმენტის სხვადასხვა ტემპერატურაზე ინკუბაციით დადგინდა, რომ როგორც ინკუბაციის დრო, ასევე ტემპერატურა გავლენას ახდენდა ფერმენტის სტაბილურობაზე. აღსანიშნავია, რომ *Trametes polyzona* NRC 620-დან მიღებული ლაკაზა უფრო მაღალ სტაბილურობას ავლენდა 40℃ და 50℃ ტემპერატურაზე, 120 წუთის შემდეგ კი შეინარჩუნა საწყისი აქტივობის შესაბამისად 68.33% და 59.61% (სურათი 3ა). ამის საპირისპიროდ, იმავე პირობებში (40℃ და 50℃, 120 წუთი), *Trametes polyzona* WRF03-დან მიღებული ლაკაზა შეინარჩუნა თავისი აქტივობის შესაბამისად 64.38% და 42.92%.³³პირიქით, ინკუბაციის დროისა და ტემპერატურის გაზრდამ შეამცირა *Trametes polyzona* NRC 620 ლაკაზას სტაბილურობა; 60℃ და 70℃ ტემპერატურაზე 60 წუთის განმავლობაში ინკუბაციის შემდეგ, მისი აქტივობა შემცირდა შესაბამისად 39.24%-მდე და 1.72%-მდე (სურათი 3ა). ექსპერიმენტული შედეგების შესაბამისად, *Trametes polyzona* WRF03-დან მიღებულმა ლაკაზამ აჩვენა უფრო მაღალი სტაბილურობა 40 და 50℃ ტემპერატურაზე მთელი თერმული დამუშავების პროცესის განმავლობაში.³³ანალოგიურად, ლუეანჯაროენკიტი და^ალ.37და ხაირინი და^ალ.42Trametes polyzona KURNW027-დან და Trametes polyzona WR710-1-დან მიღებული ლაკაზების სტაბილურობა 50°C ტემპერატურაზე, შესაბამისად, 1 საათის განმავლობაში. როგორც სასარგებლო ბიოკატალიზატორი, რომელიც გამოიყენება სხვადასხვა ბიოტექნოლოგიურ სფეროში, ლაკაზას უნდა ჰქონდეს კარგი სტაბილურობა და მახასიათებლები ფართო ტემპერატურულ დიაპაზონში.
*Pleurotus ostreatus* NRC 620-დან ლაკაზას თერმოსტატული სტაბილურობა (ა) და pH სტაბილურობა (ბ). თერმოსტატული სტაბილურობა შეფასდა ფერმენტის ხსნარის 0.05 M ნატრიუმის ფოსფატის ბუფერში (pH 7.0) ინკუბაციით შესაბამისად 40, 50, 60 და 70 °C ტემპერატურაზე 2 საათის განმავლობაში. pH სტაბილურობა შეფასდა ფერმენტის ხსნარის 0.1 M ციტრატის ბუფერსა და Tris ბუფერში (pH 3, 4, 6 და 7) 40 °C ტემპერატურაზე 2 საათის განმავლობაში ინკუბაციით. ნარჩენი აქტივობა გამოითვალა ინკუბაციის შემდეგ ABTS-ის, როგორც სუბსტრატის გამოყენებით.
ფერმენტების გამოყენებისა და შენახვის ოპტიმალური პირობების დასადგენად, ჩვენ გამოვიკვლიეთ pH-ის გავლენა ლაკაზას სტაბილურობაზე. pH-ის სხვადასხვა მნიშვნელობის ზემოქმედებამ მნიშვნელოვნად იმოქმედა ცილის სტრუქტურის სტაბილურობაზე, რითაც გავლენა მოახდინა ფერმენტის მოლეკულის სტაბილურობასა და აქტივობაზე. შედეგებმა აჩვენა, რომ ფერმენტი ნაკლებად სტაბილური იყო მჟავე პირობებში, მაშინ როდესაც მან უკეთესი სტაბილურობა აჩვენა pH-ის უფრო მაღალ მნიშვნელობებზე (ნეიტრალური და ტუტე რეგიონები). 7.0, 6.0, 4.0 და 3.0 pH მნიშვნელობების დროს, ფერმენტის შეკავების სიჩქარე 120 წუთის შემდეგ იყო დაახლოებით 100%, 62.54%, 52.39% და 11.14%, შესაბამისად (სურ. 3ბ). *Strombus multisus* WRF03 ლაკაზამ აჩვენა უფრო მაღალი სტაბილურობა ნეიტრალური pH მნიშვნელობების დროს (5.5–6.5) და უფრო დაბალი სტაბილურობა მჟავე pH მნიშვნელობების დროს (4.0-ზე ნაკლები). 120 წუთის შემდეგ, pH-ის 5.5, 6.0 და 6.5 მნიშვნელობებზე, ფერმენტების შეკავების მაჩვენებლები შესაბამისად დაახლოებით 82%, 100% და 93% იყო.³³ხაირინი და სხვ.⁴²აღნიშნეს, რომ Trametes polyzona WR710-1-დან მიღებული ლაკაზა სტაბილური იყო pH-ის 6.0-დან 7.0-მდე დიაპაზონში, ხოლო საიედმა და სხვებმა.⁴⁵აჩვენა, რომ ლაკაზა უფრო სტაბილური იყო ნეიტრალური pH პირობებში. თუმცა, Cerrena unicolor-ის ლაკაზამ ასევე აჩვენა სტაბილურობა ტუტე პირობებში (pH 9.0).⁴⁶შესწავლილმა ლაკაზებმა მაღალი სტაბილურობა აჩვენეს pH-ის ფართო დიაპაზონში. ეს შეიძლება მნიშვნელოვანი მახასიათებელი იყოს სამრეწველო გამოყენებისთვის.
ვინაიდან ზოგიერთ ლითონის იონს აქვს როგორც მასტიმულირებელი, ასევე დამთრგუნველი ეფექტი ფერმენტულ აქტივობაზე, მათი გავლენა ფერმენტულ აქტივობაზე უნდა იქნას გათვალისწინებული სამრეწველო გამოყენებაში. ეს გადამწყვეტია, რადგან ლითონის იონები წარმოადგენენ გარემოს გავრცელებულ დამაბინძურებლებს, რომლებსაც შეუძლიათ გავლენა მოახდინონ უჯრედგარე ფერმენტების სტაბილურობასა და სინთეზზე.⁴⁷*Pleurotus ostreatus* NRC 620-დან ლაკაზაზე მრავალი ლითონის იონების ზემოქმედების შესასწავლად, ჩვენ ჩავატარეთ შესაბამისი ექსპერიმენტები. როგორც ნაჩვენებია ნახაზ 4-ში, გამოყენებული ლითონის ტიპის მიხედვით, ლითონის იონების კონცენტრაციის 2.5 mM-დან 10 mM-მდე გაზრდა უარყოფითად აისახა ფერმენტის ფუნქციაზე. მაგალითად,^Mg²⁺ , ^Co²⁺ , ^Zn²⁺და^Cu²⁺შეუძლია ფერმენტული აქტივობის სტიმულირება და გააქტიურება, ამავდროულად^Na⁺ , ^Mn²⁺ , ^Ca²⁺და^K⁺შეეძლო ფერმენტის აქტივობის დათრგუნვა. 10 mM კონცენტრაციის დროს, Cu²⁺ და Mg²⁺ იონები წარმოადგენდნენ *Pleurotus ostreatus* NRC 620-ის ლაკაზას აქტივობის ყველაზე ძლიერ აქტივატორებს, რაც უზრუნველყოფდა დაახლოებით 34% და 20%-იან აქტივაციის ხარისხს, შესაბამისად. თუმცა, 10 mM კონცენტრაციის დროს, Ca²⁺ იონები წარმოადგენდნენ ლაკაზას ყველაზე ძლიერ ინჰიბიტორებს, რომლებიც ამცირებდნენ ფერმენტის აქტივობას დაახლოებით 60%-ით.
ლითონის იონების გავლენა Pleurotus ostreatus NRC 620 ლაკაზას აქტივობაზე. ლაკაზა 10 წუთის განმავლობაში ინკუბირებული იყო ნატრიუმის ფოსფატის ბუფერში (0.05 M, pH 7.0), რომელიც შეიცავდა სხვადასხვა ლითონის იონებს 2.5 mM და 10 mM კონცენტრაციით. შემდეგ რეაქცია დაიწყო სუბსტრატის (ABTS) დამატებით, რის შემდეგაც გაიზომა ფარდობითი აქტივობა.
ჩვენი შედეგები თანხვედრაშია სხვა ავტორების შედეგებთან, რომლებმაც დაადგინეს, რომ Mg²⁺ და Cu²⁺ აძლიერებენ *Trametes polyzona* WRF03³-ის აქტივობას. კასტანიომ და სხვებმა⁴⁸ აღმოაჩინეს, რომ *Xylaria* sp.-დან მიღებული ლაკაზა გარკვეულწილად სტიმულირდება სპილენძის იონებით (Cu²⁺). გარდა ამისა, ფორუტანფარმა და სხვებმა⁴⁹ და სიმ და სხვებმა⁵⁰ ჩაატარეს მსგავსი კვლევები შესაბამისად *Paraconiothyrium variabile*-სა და *Trametes pubescens*-დან მიღებულ ლაკაზებზე. ამ ფერმენტის II ტიპის სპილენძთან შეკავშირების ადგილი (T2) შეიძლება გაჯერებული იყოს Cu²⁺-ით მოცემულ კონცენტრაციაზე, რაც შეიძლება ხსნიდეს ლაკაზას აქტივობის სტიმულირებას Cu²⁺⁳⁹-ის უფრო მაღალი კონცენტრაციების დროს. ვინაიდან თეთრი ლპობის სოკოების ლაკაზები წარმოადგენენ ოქსიდაზებს, რომლებიც შეიცავენ სპილენძის მრავალ ატომს, სპილენძის იონების გავლენა ლაკაზის აქტივობაზე მრავალფეროვანია და მერყეობს სტიმულატორულიდან და ინჰიბიტორულიდან ნეიტრალურამდე.⁵¹ ამის საპირისპიროდ, ჟოუ და სხვ.^{. [52]}იტყობინება, რომ^Cu²⁺ტაივანის მიწისქვეშა ტერმიტის (Odontotermes formosanus) ლაკაზას აქტივობას აფერხებდა. თუმცა, Cerena sp. HYB07-ის ლაკაზები^[53]და Clitocybe maxima^[54]სპილენძის იონები არ იმოქმედა მათზე.
სუბსტრატის სპეციფიკურობა წარმოდგენილი იყო მისი კინეტიკური პარამეტრებით (Km და Vmax); რაც უფრო ძლიერი იყო სუბსტრატის შეკავშირების აფინურობა ფერმენტთან, მით უფრო დაბალი იყო Km მნიშვნელობა და მით უფრო მაღალი იყო სუბსტრატის სპეციფიკურობა.^3,21,55*Pleurotus ostreatus* NRC 620-დან ლაკაზას კინეტიკური პარამეტრები (Km და Vmax) განისაზღვრა GraphPad Prism 6.0 პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით Lineweaver-Burk დიაგრამის აგებით (სურათი 5). ABTS-ის სუბსტრატად გამოყენებისას, შედეგები იყო 1.99 mM და 16217 μmol.^{წთ⁻¹ ლ⁻¹,}შესაბამისად. ელსაიედი და სხვ.²¹აღმოჩნდა, რომ ABTS-ის დაჟანგვის Km მნიშვნელობები შესაბამისად 0.1 mM და 0.064 mM იყო, რაც მიუთითებს Lac A და Lac B იზოენზიმების მაღალ აფინურობაზე ABTS-ის მიმართ. გარდა ამისა, Vmax მნიშვნელობები 0.182 μmol იყო.^წთ⁻¹და 0.603 მკმოლ^წთ⁻¹, შესაბამისად. მიღებული Km მნიშვნელობა უფრო დაბალი იყო, ვიდრე Trametes polyzona WRF03-ის (8.66 mM); გარდა ამისა, მათი Vmax მნიშვნელობა (1429 mmol min⁻¹) ასევე იყო^{ქვედა}როდესაც ABTS გამოიყენება სუბსტრატად.33 ანალოგიურად, Lentinus squarrosulus MR13 და Trametes sp. AH28-2 ლაკაზას კონცენტრაციების Km მნიშვნელობები შესაბამისად 0.0714 mM და 0.025 mM იყო, ხოლო Vmax მნიშვნელობები 0.0091 mM min−1 და 0.67 mM min−1 მგ−1 (ABTS-თან შედარებით).^{, შესაბამისად.56,57}
გამოკვლეული იქნა ABTS კონცენტრაციის გავლენა *Pleurotus ostreatus* NRC 620-დან ლაკაზას აქტივობაზე და აგებული იქნა საწყისი რეაქციის სიჩქარისა და ABTS კონცენტრაციის შებრუნებული დამოკიდებულების Lineweaver-Burk დიაგრამა. ლაკაზას სხვადასხვა კონცენტრაციით (0.025–3.0 mM) ABTS-ის დაჟანგვის რეაქცია გაიზომა pH 4.5-ზე კინეტიკური პარამეტრების (Vmax და Km) დასადგენად. მაიკლის-მენტენის კინეტიკური მუდმივები გამოითვალა რეაქციის სიჩქარისა და სუბსტრატის კონცენტრაციის შებრუნებული დამოკიდებულების Lineweaver-Burk დიაგრამის გამოყენებით. კინეტიკური მუდმივები გამოითვალა Lineweaver-Burk დიაგრამიდან GraphPad Prism 6.01 პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით.
ტრადიციული გამწმენდი ფერმენტები, როგორიცაა პექტინაზები, ჰიდროლიზებენ პექტინურ ნივთიერებებს, ამცირებენ სიბლანტეს და სიმღვრივეს. ისინი ეფექტურად შლიან სტრუქტურულ პოლისაქარიდებს და ხშირად გამოიყენება სხვა ფერმენტებთან, როგორიცაა ცელულაზები და ჰემიცელულაზები, კომბინაციაში მოსავლიანობისა და გამჭვირვალობის გასაუმჯობესებლად. თუმცა, პექტინაზები კონკრეტულად არ მიმართავენ ფენოლურ ნაერთებს, რომლებიც სიმღვრივისა და ჟანგვითი შეყავისფრების ძირითადი ხელშემწყობი ფაქტორებია, განსაკუთრებით ვაშლისა და ყურძნის წვენებში.⁵⁸ამის საპირისპიროდ, ლაკაზები აკატალიზებენ ფენოლური ნაერთების დაჟანგვას, ახდენენ მათ პოლიმერიზაციას უფრო დიდ, უხსნად მოლეკულებად, რომელთა მოცილება შესაძლებელია დალექვით ან ფილტრაციით. ეს მექანიზმი არა მხოლოდ აუმჯობესებს გამჭვირვალობას, არამედ ახანგრძლივებს წვენის შენახვის ვადას ფენოლური ნაერთებით გამოწვეული ჟანგვითი შეყავისფრების ალბათობის შემცირებით. გარდა ამისა, ლაკაზაზე დაფუძნებული გასუფთავების პროცესები შეიძლება განხორციელდეს ზომიერი დამუშავების პირობებში (pH 3.5–5.5, ტემპერატურა 25–40 °C), რაც მათ შესაფერისს ხდის დელიკატური წვენებისთვის მათი კვებითი ან ორგანოლეპტიკური თვისებების კომპრომისის გარეშე.⁵⁹კვლევებმა აჩვენა, რომ პექტინაზათი დამუშავებით წვენის გასუფთავება 1-2 საათშია შესაძლებელი, მაშინ როცა ლაკაზათი დამუშავებით ფენოლური ნაერთების სრულად აღსადგენად, როგორც წესი, რეაქციის უფრო ხანგრძლივი დრო (3-6 საათი) არის საჭირო. თუმცა, ამ პროცესის ოპტიმიზაცია შესაძლებელია ფერმენტის იმობილიზაციის ან ლაკაზას მექანიკური გასუფთავების მეთოდებთან შერწყმით.⁶⁰ამ კვლევაში, ნედლი ექსტრაქტის ფერმენტული პროფილირების შედეგად გამოვლინდა ლაკაზას და α-ამილაზას მნიშვნელოვანი აქტივობა, მაშინ როდესაც პექტინაზას და ქსილანაზას აქტივობა უკიდურესად დაბალი იყო და ცელულაზას აქტივობა არ დაფიქსირებულა. ამიტომ, სიმღვრივის და ფენოლური შემცველობის შემცირება ძირითადად ლაკაზას მოქმედებით იყო განპირობებული, ხოლო სიბლანტის ცვლილება შესაძლოა ნაწილობრივ ამილაზას მოქმედებით იყოს განპირობებული.
ცხრილი 1 აჩვენებს ახლად გამოწურული ვაშლის წვენისა და ლაკაზათი დამუშავებული ნიმუშების ფიზიკურ-ქიმიურ პარამეტრებს. შედეგებმა აჩვენა, რომ ახლად გამოწურული ვაშლის წვენის გამოსავლიანობა (71.59%) უფრო დაბალი იყო, ვიდრე ლაკაზათი დამუშავებული ნიმუშების (87.34%). ეს შედეგები შეესაბამება პილნიკისა და ორანჟის დასკვნებს.⁶¹, რომლებმაც მიუთითეს, რომ ხილის გადამუშავებაში ფერმენტების გამოყენებამ შეიძლება გაზარდოს წვენის მოსავლიანობა, გააუმჯობესოს ფილტრაცია და მიიღოს მაღალი ხარისხის, გამჭვირვალე წვენი კონცენტრირებისთვის. წვენის მოსავლიანობის ზრდა ძირითადად განპირობებულია წვენში ხსნადი შაქრების შემცველობის ზრდით. ხილის ფერმენტული ჰიდროლიზის დროს, პროდუქტის უჯრედის კედლებში არსებული მეზოგლეა და პექტინი ნადგურდება და გარდაიქმნება ხსნად ნივთიერებებად, როგორიცაა ნეიტრალური შაქრები და მჟავები.^62.ფერმენტებით დამუშავებული ვაშლის წვენის pH მნიშვნელობა მნიშვნელოვნად დაბალი იყო საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით (P < 0.05) და ორივე ჯგუფის pH მნიშვნელობა მნიშვნელოვნად გაიზარდა შენახვის დროს (ცხრილი 1). ეს შედეგები შეესაბამება მარკის და სხვების შედეგებს.⁶³, რომლებმაც აღნიშნეს, რომ კეშიუს ხილის წვენის pH თერმული დამუშავების შემდეგ შენახვის შემდეგ შემცირდა. პექტინის დეგრადაცია და გალაქტურონის მჟავას წარმოქმნა ფერმენტული დამუშავების შემდეგ შესაძლოა იყოს პასუხისმგებელი შენახვის დროს pH-ის ზრდაზე. ფერმენტებით დამუშავებული ნიმუშების pH შენახვის მთელი პერიოდის განმავლობაში 4.05-დან 4.31-მდე რჩებოდა, ხოლო დაუმუშავებელი ვაშლის წვენის pH 4.12-დან 4.33-მდე მერყეობდა.
როგორც დაუმუშავებელი, ასევე ლაკაზათი დამუშავებული ნიმუშების საერთო მჟავიანობა (TA) შენახვის დროის ზრდასთან ერთად კლების ტენდენციას ავლენდა (ცხრილი 1). მჟავიანობის შემცირება განპირობებული იყო ორგანული მჟავების ნახშირწყლებად გარდაქმნით ან ფერმენტული რეაქციებით, ასევე წვენის შენახვის დროს დაჟანგვით.⁶⁴საკონტროლო ვაშლის წვენისა და ფერმენტებით დამუშავებული ნიმუშების საერთო მჟავიანობა უფრო დაბალი იყო, ვიდრე სხვა წვენებისა (მარწყვის წვენი 0.9%, ქლიავის წვენი 2.2%, კუმკვატის წვენი 1.0%, გარგარის წვენი 2.4%, ფორთოხლის წვენი 0.8%), მაგრამ მსგავსი იყო სხვა წვენებისა (მაგ., მსხლის წვენი 0.3%).⁶²დაუმუშავებელ ახლად გამოწურულ ვაშლის წვენში ეს განსხვავებები შეიძლება გამოწვეული იყოს სხვადასხვა ფაქტორებით, როგორიცაა ზრდის პირობები, გენეტიკური ფაქტორები, სიმწიფის დონე და დამუშავების მეთოდები.⁶⁵საკონტროლო და ლაკაზათი დამუშავებული ვაშლის წვენის საერთო მჟავიანობის შემცირება შეესაბამება სინგჰის და სხვების მიერ წარმოდგენილ შედეგებს.⁶⁶ჯინ ნუოს ვაშლის წვენის საერთო მჟავიანობის შემცირებასთან დაკავშირებით 74-დღიანი შენახვის შემდეგ. მეორეს მხრივ, ოშმიანსკი და ვოიდილ⁶⁷ტრადიციული გასუფთავების მეთოდების ეფექტის შესწავლისას ვაშლის წვენის მჟავიანობის რაიმე მნიშვნელოვანი ცვლილება ვერ აღმოაჩინა.
ცხრილ 1-ში წარმოდგენილი შედეგები მიუთითებს, რომ ლაკაზათი დამუშავებული ვაშლის წვენის ხსნადი მყარი ნივთიერებების საერთო შემცველობის (TSS) მაჩვენებელი უფრო მაღალი იყო, ვიდრე დაუმუშავებელი ნიმუშის. ეს შედეგები შეესაბამება გამოქვეყნებულ კვლევებს.^{. 68}გარდა ამისა, ცხრილი 1 აჩვენებს, რომ საკონტროლო ვაშლის წვენის ჯგუფის TSS მნიშვნელობა საწყის ეტაპზე 9.58 იყო და შენახვის პერიოდის ბოლოს 11.05-ს მიაღწია. ეს მნიშვნელობები უფრო დაბალია, ვიდრე ჰამიდის და სხვების მიერ მოხსენებული ახალი ვაშლის წვენის TSS მნიშვნელობები.^{. 69}(შესაბამისად, 11.2 და 11.80). ლაკაზათი დამუშავებული ვაშლის წვენის ნიმუშების TSS მნიშვნელობა მნიშვნელოვნად გაიზარდა, 11.23-დან დაწყებული და 4°C ტემპერატურაზე ორკვირიანი შენახვის შემდეგ 12.93-მდე მიაღწია (ცხრილი 1). შენახვის დროს TSS-ის მსგავსი ზრდა ასევე დაფიქსირდა ციტრუსებში, ლიმონებსა და ტკბილ ფორთოხალში. შენახვის დროს ხსნადი მყარი ნივთიერებების (TSS) საერთო რაოდენობის ზრდა შეიძლება გამოწვეული იყოს პოლისაქარიდების (სახამებლის) მონოსაქარიდებად (შაქრებად) ჰიდროლიზით, წვენის დეჰიდრატაციის გამო კონცენტრაციის ზრდით და წვენში პექტინის ხსნად მყარ ნივთიერებებად დაშლით. ხსნადი მყარი ნივთიერებების (TSS) საერთო რაოდენობის ზრდა, სავარაუდოდ, გამოწვეულია ხსნადი შაქრების ზრდით, რომლებიც შეიძლება წარმოიქმნას პექტინის ან ცელულოზის ხსნად შაქრად გარდაქმნით შესაბამისად პექტინის ან ცელულოზის მიერ, ან სახამებლის შაქრად ჰიდროლიზით, როგორც ამას ჰამედი და სხვები აცხადებენ.^69.ლაკაზას გავლენა ვაშლის წვენის თვისებებზე ვიზუალურად შეიძლება დავაკვირდეთ, რადგან ლაკაზათი დამუშავებული ვაშლის წვენი უკეთეს დინებადობას და დაბალ სიბლანტეს ავლენს, ვიდრე დაუმუშავებელი წვენი. ეს დაკვირვება ჩაწერილია ცხრილში 1; ფერმენტით დამუშავებული ნიმუშის სიბლანტე იყო 1.87 cP, ხოლო საკონტროლო ნიმუშის სიბლანტე - 2.95 cP. სიბლანტის ეს მნიშვნელოვანი შემცირება, სავარაუდოდ, განპირობებულია პექტინის მსგავსი ნივთიერებების წყლის შეკავების უფრო მაღალი უნარით და შეკრული ქსელის სტრუქტურის ფორმირებით.
ამ კვლევაში, ვაშლის წვენის შეყავისფრების ინდექსზე (BI) ლაკაზას გავლენა გამოკვლეული იქნა სპექტროფოტომეტრის გამოყენებით 420 ნმ-ზე შთანთქმის გაზომვით. შედეგები ნაჩვენებია ცხრილში 1. შენახვის დროს, როგორც დამუშავებულ, ასევე დაუმუშავებელ ჯგუფებში ვაშლის წვენის ნიმუშების BI თანდათანობითი ზრდის ტენდენციას ავლენდა. BI ასახავს შეყავისფრების ხარისხს და შეიძლება გამოყენებულ იქნას, როგორც^{მნიშვნელოვანი}ფერმენტული და არაფერმენტული შეყავისფრების რეაქციების მაჩვენებელი. შეწოვა მნიშვნელოვნად გაიზარდა შენახვის დროს (P < 0.05). შენახვის ბოლოს,_A420საკონტროლო და ფერმენტებით დამუშავებულ ჯგუფებში ვაშლის წვენის ნიმუშების ღირებულება შესაბამისად დაახლოებით 217%-ით და 121%-ით გაიზარდა (ცხრილი 1). შედეგები მიუთითებს, რომ ფერმენტებით დამუშავებას შეუძლია ეფექტურად შეამციროს შეყავისფრების ხარისხი დაახლოებით 56%-ით. ბეზერას და სხვ. კვლევის შედეგები...^[19]] შეესაბამება ჩვენს შედეგებს; ვაშლის წვენის გასასუფთავებლად მათ გამოიყენეს ლაკაზა-გლუტარალდეჰიდ-ქოქოსის ბოჭკო, რამაც მისი თავდაპირველი ფერი 61%-ით შეამცირა.
მიუხედავად იმისა, რომ ხილის წვენებში შემავალ პოლიფენოლებს დადებითი კვებითი და თერაპიული ეფექტი აქვთ ადამიანის ორგანიზმზე, მათ ასევე შეუძლიათ რეაქციაში შევიდნენ ცილებთან, რაც იწვევს წვენის ამღვრევას, დანალექს ან სიმღვრივეს, რითაც იცვლება პროდუქტის გემო და არომატი და მცირდება მისი შენახვის ვადა.⁷¹კვლევის მიზანი იყო ვაშლის წვენში ფენოლური ნაერთების შემცველობის უსაფრთხოდ შემცირება Pleurotus ostreatus NRC 620-ის ლაკაზას გამოყენებით. ცხრილში 1 წარმოდგენილი შედეგები აჩვენებს, რომ ლაკაზათი დამუშავებული ვაშლის წვენში ფენოლური ნაერთების საერთო შემცველობა მნიშვნელოვნად შემცირდა 4°C ტემპერატურაზე შენახვამდე. გარდა ამისა, ფენოლური ნაერთების საერთო შემცველობა ასევე შემცირდა შენახვის დროს ორივე შესწავლილ ნიმუშში (ცხრილი 1). კვლევა ჩაატარეს სანდრიმ და სხვებმა.⁷²აჩვენა, რომ ფერმენტებით დამუშავებული ვაშლის წვენს შეუძლია შეინარჩუნოს ანტიოქსიდანტური აქტივობა და ფენოლური ნაერთების შემცველობა. თუმცა, ლეტერას და სხვების კვლევის შედეგები.⁷³აჩვენებს, რომ ფორთოხლის წვენის სოკოვანი ლაკაზით დამუშავებას შეუძლია შეამციროს მასში ფენოლური ნაერთების შემცველობა 45%-მდე.
ფენოლური ნაერთები ხასიათდებიან ისეთი თვისებებით, როგორიცაა თავისუფალი რადიკალების შთანთქმა, სინგლეტური ჟანგბადის აღდგენა და ჩაქრობა, წყალბადის ატომის გადატანა და ელექტრონების დონაცია თავისუფალი რადიკალებისთვის, რაც მათ ძლიერ ანტიოქსიდანტებად აქცევს.⁷⁴ამიტომ, ამ კვლევაში, DPPH და FRAP-ზე დაფუძნებული მეთოდები გამოყენებული იქნა ლაკაზას ეფექტის შესაფასებლად მაცივარში 14 დღის განმავლობაში შენახული ვაშლის წვენის ანტიოქსიდანტურ აქტივობაზე (ცხრილი 2). ორივე მეთოდმა აჩვენა ანტიოქსიდანტური აქტივობის ზრდა შენახვის დროს, რაც შეიძლება გამოწვეული იყოს თავისუფალი ფენოლური ნაერთების ზრდით ან მაიარდის რეაქციის პროდუქტების (MRP) წარმოქმნით, ხოლო მაიარდის რეაქციის პროდუქტები, სავარაუდოდ, ანტიოქსიდანტური აქტივობის ზრდის მიზეზია.⁷⁵არაფერმენტული შეყავისფრების რეაქციები (მათ შორის ასკორბინის მჟავას დაშლა, მაიარდის რეაქციები და შაქრების მჟავა-კატალიზირებული დაშლა) წარმოქმნის ყავისფერ პიგმენტებს (მელანოიდინებს). შუალედური ასკორბინის მჟავას დაშლის პროდუქტები და შაქრის დაშლის პროდუქტები (მაგალითად, კარბონილის ნაერთები) შეიძლება ამინომჟავებთან რეაქციაში შევიდეს მაიარდის რეაქციების მეშვეობით.⁷⁶მიუხედავად იმისა, რომ შენახვის დროს ხილისა და ბოსტნეულის შეყავისფრება ფართოდ არის შესწავლილი, ამ რეაქციების შესახებ ჩვენი გაგება კვლავ შეზღუდულია.⁷⁷FRAP მეთოდთან შედარებით, ლაკაზათი დამუშავებულმა ვაშლის წვენმა DPPH მეთოდით მნიშვნელოვნად დაბალი ანტიოქსიდანტური აქტივობა აჩვენა (ცხრილი 2) და ყველა ნიმუშის ანტიოქსიდანტური აქტივობა მნიშვნელოვნად გაიზარდა შენახვის დროის ზრდასთან ერთად. ამ კვლევაში გამოყენებული იქნა ანტიოქსიდანტური აქტივობის დასადგენად ორი განსხვავებული მეთოდი, რადგან მათი პრინციპები განსხვავებულია. DPPH მეთოდი ზომავს თავისუფალი რადიკალების ნეიტრალიზაციის უნარს, ხოლო FRAP მეთოდი ზომავს რკინის იონების შემცირების უნარს. ამიტომ, შესწავლილი ნიმუშების ანტიოქსიდანტური აქტივობის უკეთ გასაგებად რეკომენდებულია ანტიოქსიდანტური აქტივობის დასადგენად მრავალი მეთოდის გამოყენება.⁷⁸
ამ კვლევის ერთ-ერთი მთავარი დასკვნა ის არის, რომ *Pleurotus ostreatus* ლაკაზა NRC 620 ავლენს ოპტიმალურ აქტივობას 70°C ტემპერატურაზე და pH 3.0-ზე. წვენის გასუფთავებისთვის ხშირად გამოყენებულ სხვა სოკოვან ლაკაზებთან შედარებით, როგორიცაა *Trametes versicolor* და *Ganoderma lucidum* ლაკაზები, *P. ostreatus* NRC 620 ავლენს უფრო მაღალ თერმულ სტაბილურობას და უფრო მჟავე pH-ს. *Trametes versicolor*-ისა და *Ganoderma lucidum*-ის ლაკაზები, როგორც წესი, ავლენენ ოპტიმალურ აქტივობას 50-60°C დიაპაზონში და pH 3.5-დან 5.0-მდე დიაპაზონში. ამ განსხვავებამ შეიძლება ხელი შეუწყოს წვენის გასუფთავების ეფექტურობის გაუმჯობესებას, განსაკუთრებით მჟავე წვენებისთვის, სადაც pH-ის დაბალ მნიშვნელობებზე სტაბილურობა კრიტიკულია. *P.-ის უნიკალური მახასიათებელი, სხვა შესწავლილ სოკოვან ლაკაზებთან შედარებით, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 ავლენს ეფექტურად ფუნქციონირების უნარს უფრო რთულ პირობებში. მისი უფრო მაღალი ოპტიმალური აქტივობის ტემპერატურა მიუთითებს სამრეწველო გამოყენებაში პოტენციურ უპირატესობებზე, როგორიცაა რეაქციის უფრო სწრაფი სიჩქარე და მიკრობული დაბინძურების შემცირება. მისი დაბალი pH, რომელიც კარგად ერგება მრავალი წვენის მჟავე ბუნებას, შეიძლება სასარგებლო იყოს წვენის გასუფთავების პროცესებში. ეს შედეგები ამართლებს შემდგომ კვლევას ფართომასშტაბიანი გამოყენებისთვის, რაც *Pleurotus ostreatus* NRC 620-ს ტრადიციული სოკოვანი ლაკაზას წყაროების სიცოცხლისუნარიან ალტერნატივად აქცევს. წინა კვლევებთან შედარებით, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ ოპტიმალური ტემპერატურაა 60°C, ხოლო ოპტიმალური pH 3.0. 60°C-ზე 80 წუთის განმავლობაში რეაქციის შემდეგ, *Ganoderma lucidum* ლაკაზა შენარჩუნებულია.⁴⁶მისი აქტივობის %.79 კურნიავატისა და ნიკელის მიხედვით⁸⁰*Ganoderma lucidum* ფერმენტები ავლენენ შესანიშნავ და საშუალო სტაბილურობას 25°C ტემპერატურაზე და pH-ის 5.0-დან 8.0-მდე დიაპაზონში, ხოლო სტაბილურობას pH 6.0-ზე და ტემპერატურაზე 10-დან 30°C-მდე დიაპაზონში. ამ კვლევაში ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ *Pleurotus ostreatus*-ისთვის ფერმენტული აქტივობისთვის ოპტიმალური pH და ტემპერატურა შესაბამისად 3.0 და 70°C იყო. 40°C და 50°C ტემპერატურაზე ორსაათიანი ინკუბაციის შემდეგ, ფერმენტმა შეინარჩუნა თავისი აქტივობის 68.33% და 59.61% შესაბამისად. გარდა ამისა, Pleurotus ostreatus NRC 620 ლაკაზამ აჩვენა მაღალი აქტივობა ფართო ტემპერატურის დიაპაზონში 50°C-დან 80°C-მდე, თითქმის მიაღწია მაქსიმალურ აქტივობას (69%-98%), მაქსიმალური აქტივობა დაფიქსირდა 70°C-ზე.
დასკვნის სახით, სტატიკურ პირობებში მიღებულმა ხამანწკის სოკოს ლაკაზამ NRC620 აჩვენა ოპტიმალური აქტივობა და სტაბილურობა pH-ისა და ტემპერატურის სხვადასხვა პირობებში, რაც სხვა ფერმენტულ წყაროებთან შედარებით უკეთესი სტაბილურობის მაჩვენებელია. 10 mM MgSO₄-ის და CuSO₄-ის დამატებამ ფერმენტის აქტივობა შესაბამისად დაახლოებით 21%-ით და 35%-ით გაზარდა. ვაშლის წვენში გადამუშავებისას, ფერმენტმა შეამცირა pH და სიბლანტე, ხოლო ფენოლური შემცველობა შენახვის დროს მხოლოდ უმნიშვნელოდ შემცირდა.
შედეგები ადასტურებს ლაკაზას პოტენციალს კვების მრეწველობაში, განსაკუთრებით სასმელების გასუფთავებაში. ფენოლური ნაერთების სპეციფიკური დაშლით, ლაკაზა არა მხოლოდ ამცირებს სიმღვრივეს და აუმჯობესებს გამჭვირვალობას, არამედ ინარჩუნებს ხილის წვენების ხარისხს ზომიერი ექსპლუატაციის პირობებშიც. ტრადიციული გამწმენდი აგენტებისგან, როგორიცაა ჟელატინი, ბენტონიტი და სილიციუმის გელი, განსხვავებით, ლაკაზა არ წარმოქმნის ნარჩენებს და არ აშორებს სასიამოვნო არომატებს სასმელებიდან, რაც მას უფრო ეკოლოგიურად სუფთა და მდგრად ვარიანტად აქცევს. გარდა ამისა, სხვა ფერმენტებთან და ფილტრაციის მეთოდებთან შედარებით, ლაკაზა გვთავაზობს მიზანმიმართულ და ეკონომიურ გადაწყვეტას პროდუქტის ხარისხის შელახვის გარეშე.
კიომუჰიმბო, ჰ.დ. და ბრინკი, ჰ.გ. სპილენძის შემცველი ლაკაზების გამოყენება და იმობილიზაციის სტრატეგიები; მიმოხილვა. Heliyon 9, e13156 (2023).